李春慧１，２，蒲万霞１，吴 润２
（１．中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室／甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州 ７３００５０；２．甘肃农业大学动物医学院，兰州 ７３００７０）
摘要：选取３种不同浓度的酵母菌制剂（１．６７×１０－２、５．００×１０－２、８．００×１０－２ ｇ／ｍＬ）分为试验组１、２和３，在４ ℃下保存３６０ ｄ，每３０ ｄ取样１次，采用稀释平板法进行活酵母菌计数，检测酵母菌制剂保存的稳定性。结果表明，随着保存时间延长，试验组1、3的活酵母菌数呈下降趋势，试验组2的活酵母菌数呈先下降后升高的趋势。在第３０、９０、１８０和３６０ 天时，试验组１酵母菌存活率分别为７６．２７％、２８．６４％、２０．８５％和１１．１０％，试验组２酵母菌存活率分别为１０６．２５％、１３．６３％、１２１．２５％和１０１．８８％，试验组３酵母菌存活率分别为１２６．３７％、９０．１１％、６９．７８％和５６．０４％。可见，酵母菌制剂试验组３保存的稳定性良好，４ ℃条件下保存期可达到１８０ ｄ以上。
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关键词 ：酵母菌；制剂；保存；稳定性
中图分类号：Ｓ８５９．１；Q93-336 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1661-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.033
在抗生素限制使用的时代，微生态制剂作为较理想的替代品被广泛应用。微生态制剂又称为微生态调节剂，是指可以提高人类、畜禽宿主或植物寄主等健康水平和促进生长的菌群及其代谢产物的制品［１］，具有无毒副作用、无残留和无耐药性等特性。目前，用于微生态制剂的微生物主要有芽孢杆菌属、乳杆菌属和酵母菌属等［２］。其中，酵母菌属于兼性厌氧型真菌，可以耐受一定剂量的抗生素，而大多微生态制剂是细菌制剂，对抗生素敏感，所以酵母菌能在含有抗生素的机体或环境中应用，并逐渐取代抗生素。此外，酵母菌菌体含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素等成分，还可以分泌酶类、糖类、脂类和生长因子等［３］。酵母菌是继动物蛋白质和植物蛋白质之后的一种重要蛋白质来源，又有“菌体蛋白质”之称［４］。研究表明，每１００ ｋｇ干酵母所含的蛋白质，相当于５００ ｋｇ大米、２１７ ｋｇ大豆或２５０ ｋｇ猪肉所含蛋白质的含量［５］。
酵母菌有着悠久的应用史，尤其在面包制作和酿酒行业。近几年，酵母菌以微生态制剂的形式广泛应用于食品、保健品、药品、饲料等行业。酵母菌制剂主要作为多功能食品、保健品、添加剂和医药品，甚至用作含重金属废水的净化剂等［６，７］。微生态制剂中起重要作用的是活性微生物，保证制剂中活性微生物的含量对其发挥益生作用至关重要。
酵母菌制剂保存的稳定性是指该制剂从制备到使用期间活酵母菌数的变化速度和程度，是评价制剂质量的重要指标之一。稳定性研究是制剂质量控制研究的主要内容之一，与制剂质量研究和质量标准的建立紧密相关。本研究通过对酵母菌制剂在一定条件下活菌数随时间变化规律进行研究，掌握制剂保存的稳定性变化，为制剂的临床应用提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 菌种 酵母菌液由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所提供。
１．１．２ 试剂与培养基 琼脂粉购自生工生物工程（上海）股份有限公司；麦芽汁购自兰州啤酒厂；固体麦芽汁：琼脂粉＋麦芽汁。
１．１．３ 仪器 电子天平（武汉格莱莫检测设备有限公司），ＰＨＳＪ－４Ｆ型实验室ｐＨ计（上海仪电科学仪器股份有限公司），ＬＤＺＸ－３０ＫＢ型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），ＢＳ－２Ｆ型数显振荡培养箱（金坛市华城开元实验仪器厂），恒温培养箱（上海申贤恒温设备厂）。
１．２ 方法
取１ ｍＬ浓度为１．０×１０７ ＣＦＵ／ｍＬ的酵母菌液加入９９ ｍＬ麦芽汁培养基，培养７２ ｈ后4 ℃保存，作为供试菌液。将供试菌液从４ ℃取出后室温放置１ ｈ，置于摇床１ ｈ（速度１１０ ｒ／ｍｉｎ），以使菌液均匀。取１００ μＬ菌液加入到９ ９００ μＬ无菌生理盐水中，菌液浓度稀释１０－１，振荡１ ｍｉｎ，依次稀释１０－２、１０－３、１０－４、１０－５和１０－６，选取３种不同浓度供试菌液（１．６７×１０－２、５．００×１０－２、８．００×１０－２ ｇ／ｍＬ）作为试验处理，分别为试验组１、２和３，涂布于固体麦芽汁培养基，置于２８ ℃恒温箱培养４８～７２ ｈ（做３次平行，取其平均值）。试验组1、2和3添加某种物质，对照组不添加该种物质。将３种不同浓度酵母菌制剂及其同期对照组于冰箱４ ℃保存，试验期为３６０ ｄ，每３０ ｄ取样１次，采用稀释平板计数法进行活酵母菌计数，以平均活酵母菌数表示制剂保存的稳定性。
２ 结果与分析
对不同浓度酵母菌制剂及其同期对照组进行０～３６０ ｄ保存稳定性的检测，测定结果如图1所示。由图1可知，随着保存时间的延长，试验组1、3的活酵母菌数呈下降趋势，试验组2的活酵母菌数呈先下降后升高的趋势；在相同时间内，除试验组2保存90 d外，所有试验组的酵母菌存活率均高于对照组；与保存９０～３６０ ｄ相比，在０～９０ ｄ内试验组1、3和对照组的活酵母菌数存活率均偏高。在第３０、９０、１８０和３６０天时，试验组１酵母菌存活率分别为７６．２７％、２８．６４％、２０．８５％和１１．１０％，试验组２酵母菌存活率分别为１０６．２５％、１３．６３％、１２１．２５％和１０１．８８％，试验组３酵母菌存活率分别为１２６．３７％、９０．１１％、６９．７８％和５６．０４％。试验组１酵母菌存活率均低于试验组２和３；试验组２酵母菌存活率大部分测定时间高于１００％。说明酵母菌制剂试验组３保存的稳定性良好。
３ 小结与讨论
目前，微生态制剂保存的稳定性是确保制剂使用效果的基础。张世风等［８］报道温度对菌种保存期存活率影响最大，微生物添加剂保存温度一般为２～８ ℃。钟青萍等［９］报道纳豆菌微生态制剂在４ ℃冷藏保存，有较好的稳定性。因此，本试验选取４ ℃冷藏保存酵母菌制剂。
近年来，大多微生态制剂通过胶囊化、添加保护剂和冻干等形式，提高制剂保存稳定性。宋文龙等［１０］采用乳化和挤压法包埋枯草芽孢杆菌活菌制剂；徐晖等［１１］研究微胶囊化枯草芽孢杆菌制剂，均在４ ℃冷藏下保存，提高了制剂保存的稳定性。彭虹旎等［１２］报道添加保护剂的屎肠球菌冻干样品，在４ ℃存放４周后，存活率高于97.90％。蔡凯凯［１３］将纳豆芽孢杆菌制剂制成冻干产品４ ℃存放１个月，菌制存活率为９１．４％；固态发酵产品４ ℃存放１个月，菌制存活率为４９．１％。本试验制备不同浓度酵母菌制剂，于４ ℃冷藏保存，测定酵母菌制剂的保存稳定性。
本试验结果表明浓度不同，酵母菌制剂的酵母菌存活率不同。在不同时期，试验组１酵母菌存活率均低于试验组２和３；试验组２酵母菌存活率大部分时间高于１００％；试验组３酵母菌存活率逐渐下降，但１８０ ｄ时酵母菌存活率为６９．７８％，３６０ ｄ时还高于５０％。相关研究表明，在低于０ ℃或高于４７ ℃时，酵母菌一般不会增殖。试验组２酵母菌存活率大部分时间高于１００％，可能是酵母菌在４ ℃保存时增殖引起的，有待于进一步研究。本试验各试验组酵母菌存活率的结果与沈丽琳等［１４］报道基本一致，并且优于史怀平［１５］的报道结果。此外，在不同时期，除试验组2保存９０ ｄ外，本试验中所有试验组的酵母菌存活率均高于对照组。本试验结果表明，酵母菌制剂试验组３保存的稳定性良好，４ ℃条件下保存期为１８０ ｄ时，酵母菌存活率较高。选择适宜的浓度可以提高酵母菌制剂保存的稳定性，其作用机理有待进一步研究。
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