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单叶蔓荆总黄酮的提取工艺研究

代现平,班翠红

(滨州医学院药学院,山东 烟台 264003)

摘要:以提取温度、提取时间、固液比和乙醇体积分数为考察因素,以单叶蔓荆(Vitex rotundifolia L.)总黄酮得率为考核指标,应用正交试验对其提取工艺进行优化。结果表明,单叶蔓荆中总黄酮的最佳提取工艺为提取温度70 ℃、时间1 h、固液比1∶12(m∶V)、乙醇体积分数70%。该提取工艺简单、高效,适用于单叶蔓荆的总黄酮提取。

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关键词 :单叶蔓荆(Vitex rotundifolia L.);总黄酮;正交试验;提取工艺

中图分类号:R284.2文献标识码:A文章编号:0439-8114(2015)05-1163-03

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.034

收稿日期:2014-07-29

基金项目:国家自然科学基金项目(31170320)

作者简介:代现平(1970-),男,河南鹤壁人,副教授,博士,主要从事天然活性成分研究,(电话)13625357836(电子信箱)xianpingd@163.com。

牡荆属(Vitex L.)植物为马鞭草科灌木或乔木,主要分布在热带及温带地区。在我国有14种,主要分布在长江以南地区,在东北、华北、西北等地也有少量分布[1]。单叶蔓荆(Vitex rotundifolia L.)为牡荆属马鞭草科,辛苦微寒,具清利头目、疏散风热等功效,民间常用于头痛、眼痛、感冒等病症的治疗[2-7]。研究表明,单叶蔓荆的化学成分主要包括黄酮类、倍半萜、二萜类、三萜类、苯丙素类、甾类等物质[3-7],其中黄酮类化合物为其主要活性成分,具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、镇痛等多种药理作用[5-11]。因此,研究单叶蔓荆中总黄酮的提取工艺具有重要意义。

本试验采用正交试验对单叶蔓荆提取工艺进行优化,对影响提取的各种因素及条件进行了探讨,旨在为单叶蔓荆的综合开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

单叶蔓荆由烟台益生堂药业有限公司提供,经滨州医学院药学院天然药物实验室鉴定为单叶蔓荆。

1.2 仪器

U-190型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);JA5003B型电子天平、DHG-9053型真空干燥箱(上海精密仪器仪表有限公司);THH-6型恒温水浴锅(上海乔跃电子有限公司);SHZ-Ⅲ型循环水式多用真空泵、RE-301型旋转蒸发仪(巩义市瑞德仪器设备有限公司)。

1.3 试剂

芦丁对照品(中国药品生物制品检定所),其他试剂均为分析纯。

1.4 方法

1.4.1 单叶蔓荆中总黄酮含量的测定

1)供试样品溶液的制备。准确称取单叶蔓荆粗粉30 g,于1 000 mL烧瓶中,按要求加入不同体积分数乙醇溶液,加热回流提取一定时间,过滤,减压回收溶剂,干燥,称重,得到单叶蔓荆干膏。精确称取在不同提取条件下得到的单叶蔓荆干膏10 mg,于10 mL容量瓶中,用60%乙醇溶解,定容后备用。

2)标准溶液的制备。精确称取于120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品10 mg,于100 mL容量瓶中,加60%乙醇30 mL,水浴微热使其完全溶解,放冷,60%乙醇定容至100 mL,制成0.100 mg/mL芦丁对照品溶液。

3)标准曲线的绘制。分别精确吸取芦丁对照溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL,分别加入25 mL容量瓶中,各加0.75 mL亚硝酸钠溶液(50 mg/mL),摇匀,静置10 min;再加入0.75 mL硝酸铝溶液(100 mg/mL),摇匀,静置10 min;再加10 mL氢氧化钠溶液(40 mg/mL),60%乙醇定容,摇匀,静置10 min。于510 nm波长处测吸光度,以吸光度A为纵坐标,芦丁浓度C为横坐标,绘制标准曲线。

4)精密度试验。精确吸取2.0 mL芦丁对照溶液于25 mL容量瓶中,按标准曲线绘制方法,平行操作5次,测定该方法的精密度。

5)稳定性试验。取适量供试溶液,按标准曲线绘制方法,于0、2、4、6、8 h分别测定其吸光度,测定该方法的稳定性。

6)重复性试验。取同一批药材,按照以上方法制备供试样品溶液,并按标准曲线绘制所述方法测定吸光度,平行操作5次,测定该方法的重复性。

7)回收率试验。精确吸取6份已知含量供试样品溶液各0.5 mL,加入芦丁标准品溶液,按标准曲线绘制方法测定其吸光度,计算单叶蔓荆总黄酮的含量。

供试样品总黄酮含量测定:精确吸取5 mL供试样品溶液于25 mL容量瓶中,按标准曲线绘制项方法测定其吸光度,并代入回归方程,计算单叶蔓荆总黄酮的含量。

1.4.2 正交试验 为寻找最佳的提取条件组合,在单因素试验结果[单因素最佳条件为提取次数3次、提取温度60 ℃、提取时间2 h、固液比1∶10(m∶V,下同)和乙醇体积分数70%]的基础上,应用正交试验设计,选择了主要影响提取效果的提取温度(A)、提取时间(B)、固液比(C)和乙醇体积分数(D)作为考察因素,每个因素选择3个水平,以总黄酮含量作为考核指标,按照L9(34)正交设计方案进行试验,正交试验因素及水平见表1。

1.4.3 验证试验 采用筛选后得到的最佳工艺,进行验证试验,3次重复,按标准曲线绘制方法测定其吸光度,计算单叶蔓荆总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

以吸光度A为纵坐标,芦丁浓度C为横坐标绘制标准曲线,并进行线性回归分析,得到的回归方程为A=0.057 0C-0.008 3(r=0.999 8)。结果表明,芦丁在0.004~0.045 mg/mL浓度范围与其吸光度呈良好的线性关系。

精密度试验结果表明,该测定方法RSD=0.28%,表明其精密度良好。稳定性试验结果表明,该测定方法RSD=1.27%,表明在8 h内测定供试样品,其总黄酮含量基本稳定。重复性试验结果表明,该测定方法RSD=1.52%,表明该方法具有良好的重复性。回收率试验结果表明,单叶蔓荆总黄酮平均回收率为99.29%,RSD=1.35%,表明该方法可行。

2.2 单叶蔓荆总黄酮提取工艺优化

2.2.1 正交试验结果 正交试验试验结果见表2,方差分析结果见表3。结果表明,影响单叶蔓荆总黄酮提取的主次因素依次为A、D、C、B,即提取温度、乙醇体积分数、固液比、提取时间。方差分析结果表明,因素A和D对试验结果有极显著影响,因素C对试验结果有显著影响。按照方差分析结果,只对有显著影响因素选择最佳水平,而试验结果影响不大的因素则按照实际需要选择合适的水平。因此,单叶蔓荆总黄酮提取最佳工艺确定为提取温度70 ℃、提取时间1 h、固液比1∶12、乙醇体积分数70%,即A3B1C3D2。

2.2.2 验证试验 验证试验结果表明,单叶蔓荆总黄酮的含量分别为2.50、2.49、2.52 mg/g,平均含量为2.50 mg/g,RSD=0.63%(n=3),表明该工艺条件稳定、可靠。

3 小结与讨论

在前期单因素试验中,对单叶蔓荆总黄酮提取过程中粒度、提取温度、提取时间、固液比和乙醇体积分数单因素进行筛选,结果单叶蔓荆粒度对提取效率的影响很小,因此选择对提取效率有较大影响的提取温度、提取时间、固液比和乙醇体积分数为考察因素,进行正交试验,优选其最佳提取条件。经正交试验结果分析,发现影响单叶蔓荆总黄酮提取主次因素依次为提取温度、乙醇体积分数、固液比、提取时间。经综合分析各种因素,选定A3B1C3D2为单叶蔓荆总黄酮最佳的提取工艺,即提取温度70 ℃、提取时间1 h、固液比1∶12、乙醇体积分数70%,按此条件提取,总黄酮含量达到2.50 mg/g,并通过验证试验表明该提取工艺稳定、可靠。

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参考文献:

[1] 李春正,苏艳芳,靳先军.牡荆属植物化学成分及生物活性研究进展[J].中草药,2005,36(6):930-938.

[2] 徐月灿.蔓荆子提取物的有效成分研究及其含量测定[J].生命科学仪器,2008,6(7):54-55.

[3] SHEN J K, DU H P, YANG M, et al. Casticin induces leukemic cell death through apoptosis and mitotic catastrophe[J]. Ann Hematol,2009, 88(8):743-752.

[4] DENG Y. Bioactive constituents of two medicinal plants from indonesia[D]. Ohio: Ohio State University, 2010.

[5] ONO M, YAMAMOTO M, YANAKA T,et al. Ten new labdane-type diterpenes from the fruit of Vitex rotundifolia[J]. Chem Pharm Bull, 2001, 49(1): 82-86.

[6] YOSHIOKA T, INOKUCHI T, FUJIOKA S,et al. Phenolic compounds and flavonoids as plant growth regulators from fruit and leaf of Vitex rotundifolia[J]. Z Naturforsch C, 2004, 59(7-8):509-514.

[7] KAWAZOE K, YUTANI A, TAMEMOTO K, et al. Phenylnaphthalene compounds from the subterranean part of Vitex rotundifolia and their antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. J Nat Prod,2001, 64(5): 588-591.

[8] LUECHA P, UMEHARA K, MIYASE T, et al. Antiestrogenic constituents of the Thai medicinal plants Capparis flavicans and Vitex glabrata[J]. J Nat Prod, 2009, 72(11): 1954-1959.

[9] GUHA G, RAJKUMAR V, ASHOK, et al. Polyphenolic constituents of methanolic and aqueous extracts of Vitex negundo render protection to Hep3B cells against oxidative cytotoxicity[J]. Food Chem Toxicol,2010, 48(8-9): 2133-2138.

[10] VILLEGAS G?魷MEZ C, MART?魱NEZ-V?魣ZQUEZ M, ESQUIVEL B, et al. Antifeedant activity of anticopalic acid isolated from Vitex hemsleyi[J]. Z Naturforsch C,2009, 64(7-8): 502-508.

[11] ANANDAN R, JAYAKAR B, KARAR B, et al. Effect of ethanol extract of flowers of Vitex trifolia Linn. on CCl4 induced hepatic injury in rats[J]. J Pharm Sci,2009, 22(4): 391-394.

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