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一株产香真菌的筛选鉴定及脂肪酶基因序列克隆分析

孙 媛1a,余玉莎1a,李梦娇1a,周 斌2,张芬芬1b,李 玲1a,王继英1a,赵明富1a,文国松1b

(云南农业大学,a.农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室;b.农学与生物技术学院,昆明 650201;

2.云南大学微生物研究所,昆明 650091)

摘要:从香料植物天竺葵上分离筛选到一株产香真菌,对该菌株进行鉴定,确定其分类地位,并克隆其产脂肪酶基因进行序列分析。结果表明,分离筛选得到的菌株TZK-1形态为菌落圆形,质地疏松,菌丝由白色变为灰褐色,菌丝无隔膜,有假根,孢囊梗基部膨大形成球形孢子囊,孢囊孢子椭圆形;该菌株18S rDNA序列与米根霉Rhizopus oryzae(KF717370)相应片段的核苷酸序列同源性为99.6%。利用PCR扩增得到脂肪酶基因,该基因编码区全长为1 108 bp,编码369个氨基酸,脂肪酶核苷酸序列与推导的氨基酸序列与Rhizopus oryzae(AF229435)和Rhizopus oryzae(JN689988)聚为一支,支持强度分别达到92%和95%。结合形态学初步确定,产生浓郁甜酒香味的菌株为米根霉,能产生脂肪酶,克隆其脂肪酶基因全长。

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关键词 :真菌;筛选;脂肪酶;PCR扩增

中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:0439-8114(2015)05-1227-05

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.050

收稿日期:2014-08-08

基金项目:云南省烟草公司项目“微生物菌剂在烟草病害防治中的应用研究”(2011YN58)

作者简介:孙 媛(1988-),女,云南曲靖人,在读硕士研究生,研究方向为植物病理,(电话)13577142053(电子信箱)183658794@qq.com;

通信作者,赵明富,副教授,主要从事植物病理和微生物研究,(电子信箱)zhaomingfu@163.com;文国松,副研究员,主要从事中药材研究,

(电子信箱)wengs@163.com。

脂肪酶(Lipase,E.C.3.1.1.3)是一类特殊的酯酶,可以在油水界面上催化长链甘油酯水解为长链脂肪酸和甘油,在非水相系统中,可以催化转酯和酯合成等多种反应[1]。通过改变反应体系的水含量便可以控制脂肪酶催化的反应方向,可以进行水解、酯合成、酯交换、转酯化等一系列反应。脂肪酶在常温常压下反应具有反应条件温和、转化率高和特异性强,不易产生副产物等特点,从而能避免化学催化带来的有害物质。因此,脂肪酶越来越多地运用于光学活性化合物和天然产物的合成,如在食品、饲料、洗涤、纺织、能源等加工业中应用广泛[2,3],成为重要的工业酶制剂之一。脂肪酶广泛存在于植物、动物和微生物中,其中微生物脂肪酶具有种类多、底物专一性类型多、独立的脂肪酶基因易获得等优点[4],因而微生物是脂肪酶的一个重要来源,其中根霉属(Rhizopus sp.)是脂肪酶的重要生产菌[5]。根霉属(Rhizopus sp.)是一类分布较为广泛的真菌,属于接合纲毛霉目毛霉科,分布于酒曲、植物残体、腐败有机物、动物粪便和土壤中,在传统和现代发酵工业中有着重要作用。其中与生物技术相关的根霉有匍枝根霉(R.stolonifer)、华根霉(R.chinensis)[6]、德氏根霉(R. delemar)[7]和米根霉(R.oryzae)[8-11]。目前已从根霉属中分离到超过30种脂肪酶,如米根霉脂肪酶、雪白根霉脂肪酶、德氏根霉脂肪酶等,这些酶已经商品化,如根霉脂肪酶用于芳香酯[6]、生物柴油[12]、手性化合物[13]等有机化学物的制备,因此根霉脂肪酶具有一定的研究价值。

目前,已经从不同种属的微生物中分离得到产脂肪酶菌株,并对其进行了深入研究。随着分子生物学[14]的发展,国内外报道了不同来源微生物脂肪酶基因已被成功克隆[15],通过数据库比对分析脂肪酶序列,可以发现在相同或者相近的种属内脂肪酶的同源性相对较高,从而找到相对保守的结构域。本研究从石林香料植物天竺葵叶表面分离到一株产脂肪酶菌株,通过提取基因组DNA以真菌通用引物(ITS1/ITS4)进行PCR扩增,并结合形态学对该菌株进行鉴定,然后设计引物利用PCR扩增米根霉脂肪酶全基因序列,并对分离菌株进行发酵代谢成分分析,为米根霉的运用提供了异源表达和分子育种材料,为其代谢产物的研究和开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 由石林香料天竺葵样品中自行分离、纯化并保存的菌株。

1.1.2 主要试剂和仪器 酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、乙酸乙酯、无水硫酸钠等均为国产分析纯;2×Power Taq PCR Master Mix试剂盒、BM2000 DNA Mark购自北京百泰克生物有限公司;引物合成及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。仪器包括离心机、PCR仪、旋转蒸发仪、美国Agilent 7890/5975型气质联用仪、Agilent色谱工作站、NIST 05谱库等。

1.1.3 培养基 酵母液体培养基:酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g,加水定容至1 000 mL。酵母固体培养基:酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g,加水定容至1 000 mL。油脂培养基:蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、NaCl 5 g、香油10 g、1.6%中性红水溶液1 mL、琼脂20 g,加水定容至1 000 mL,pH 7.2。发酵液体培养基:蓖麻油5 mL、吐温-80 0.2 g、市售麦芽粒20 g,加水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 产香菌株的分离和筛选 将天竺葵的叶片用无菌剪刀由叶柄端剪下接种于装有30 mL已灭菌的酵母液体培养基的200 mL三角瓶中,置于28 ℃恒温培养箱中富集培养2~3 d,待培养基变浑浊,样品表面形成菌时将其进行梯度稀释,涂布于新鲜的酵母固体培养基平板上,置于28 ℃恒温培养,待长出菌落后进行纯化培养并将其接种于发酵液体培养基中,置于28 ℃恒温摇床培养3 d,通过嗅觉初步判断发酵液是否产生香味,斜面保存菌种。

利用因pH改变而变色的化合物作为指示剂对产脂肪酶菌株进行筛选,先将分离、纯化的菌株接种于酵母固体培养基平板中,置于28 ℃培养箱中恒温培养3 d,进行菌种活化,待其生长后再将其接种于油脂培养基平板中,置于37 ℃培养箱中培养,待菌生长后观察平板底层,如果出现红色斑点则为阳性,说明有脂肪酶产生。

1.2.2 产香菌株的形态学观察和18S rDNA鉴定

1)形态学观察。将菌株接种于酵母培养基平板上,于28 ℃恒温培养2 d。参考《真菌分类学鉴定手册》[16]对菌落形态和显微形态进行观察。

2)DNA提取和ITS rDNA 序列PCR扩增。用酵母培养基平板培养TZK-1,待其生长后刮取并收集菌丝,根据He[17]SDS-CTAB法提取该菌株基因组总DNA,略有改进。以提取的总DNA为模板,用ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增。采用2×Power Taq PCR Master Mix 试剂盒,扩增总体系50 ?滋L。反应体系:2×Power Taq PCR Master Mix 25 ?滋L,上、下游引物各2 ?滋L,DNA 11 ?滋L,ddH2O 10 ?滋L。扩增条件:94 ℃,3 min;94 ℃,40 s;55 ℃,40 s;72 ℃,1 min,共30个循环;72 ℃,10 min。PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,将扩增的PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,测序结果在NCBI上进行BLAST比对,并用Bioedit软件进行多序列比对,再提交序列至GenBank,获取登录号。

1.2.3 脂肪酶基因扩增及其序列分析 以提取的基因组总DNA为模板,根据脂肪酶高度保守序列的引物Z1、Z2(表1)对该基因进行PCR扩增, PCR扩增体系同上,采用2×Power Taq PCR Master Mix 试剂盒。扩增条件:94 ℃,3 min;94 ℃,1 min;52 ℃,45 s;72 ℃,1 min,30个循环;72 ℃,10 min,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并对扩增的PCR产物进行测序。

根据测序结果在NCBI上对保守序列进行比对,选取同源性高的菌株,利用Clustal W2软件对选取菌株进行比对,寻找保守序列。利用Primer 5.0软件根据保守序列设计引物Z3、Z4(表1),对该菌脂肪酶基因进行PCR扩增, PCR扩增体系同上。反应条件:94 ℃,3 min;94 ℃,1 min;59 ℃,45 s;72 ℃,1 min 30 s,35个循环;72 ℃,10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并对扩增的PCR产物进行测序。

根据测序得到的上述2次核苷酸序列拼接设计引物LAD1-1(表1),利用引物LAD1-1、Z2 PCR扩增该脂肪酶的全基因序列,PCR扩增体系同上。反应条件:94 ℃,3 min;94 ℃,1 min;52 ℃,45 s;72 ℃,1 min,30个循环;72 ℃,10 min,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并将扩增的PCR产物送去测序。测序结果在NCBI上进行BLAST比对,利用BLAST搜索GenBank数据库中与该序列同源性较高的菌株序列,采用Bioedit软件进行多序列比对,利用软件MEGA 5.0以Neighbor-Joining法构建产脂肪酶菌株的系统发育树,Bootstrap值为1 000。

2 结果与分析

2.1 产香菌株的分离、筛选

利用酵母液体培养基对天竺葵的叶片进行富集培养,酵母培养基变浑浊,样品表面有菌形成,将其进行梯度稀释涂布于酵母固体培养基中培养,成功分离得到菌株,对其进行纯化。再将分离、纯化的菌株接种于发酵液体培养基中进行产香筛选,培养3 d后对其发酵液进行产香嗅觉初步判断。结果发现,分离、纯化得到的菌株能产生浓郁的甜酒香味,成功筛选得到一株产香菌株。将分离、纯化的产香菌株命名为TZK-1。将TZK-1菌株接入油脂培养基平板培养,以筛选产生脂肪酶的菌株,经过37 ℃恒温培养2 d观察到TZK-1菌株平板底层出现红色斑点,如图1所示。由此可见,该菌株为脂肪酶产生菌。

2.2 产香菌株的形态学和18S rDNA鉴定

TZK-1菌株在酵母培养基培养2 d后,菌落圆形,质地疏松,菌丝由白色变为灰褐色;在显微镜下观察到菌丝无隔膜,有假根,孢囊梗基部膨大形成球形孢子囊,孢囊孢子椭圆形,如图2所示。参考真菌分类鉴定手册,初步确定为根霉属。以TZK-1菌株的DNA为模板,利用真菌通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增并对相应PCR产物进行测序。测序结果表明,该菌株长度为611 bp,将序列提交GenBank获得登陆号为KJ755444。利用BLAST软件将所得基因序列与NCBI数据库的序列进行同源性比较分析,利用Bioedit进行多序列比对,结果见表2。分析结果表明,TZK-1菌株与Rhizopus oryzae(KF717370)菌株的同源性较高,达到99.6%,TZK-1菌株与米根霉可能具有共同的起源。

2.3 脂肪酶基因扩增及系统发育分析

以提取的TZK-1总DNA为模板,利用引物Z1、Z2进行脂肪酶基因PCR扩增,结果得到约400 bp的扩增产物,与预期结果一致。根据测序结果在NCBI上对保守序列进行比对,选取同源性高的菌株,利用Clustal W2软件对选取的菌株进行比对,寻找保守序列。利用Primer 5.0软件设计的引物Z3、Z4对该菌脂肪酶基因进行PCR扩增,结果得到约800 bp的扩增产物,与预期结果一致。

根据2次测序结果拼接核苷酸序列设计引物LAD1-1,利用引物LAD1-1、Z2扩增完整的目的基因,经测序、拼接得到完整的脂肪酶基因,该脂肪酶基因片段大小为1 108 bp,编码369个氨基酸。经过3次PCR扩增,成功扩增得到脂肪酶基因,并利用凝胶成像系统观察,结果如图3所示。

将扩增得到的序列与GenBank数据库中序列进行比对,选取比对的14组核苷酸序列进行系统发育分析,用软件MEGA 5.0以Neighbor-Joining法构建产脂肪酶菌株的核苷酸系统发育树,结果如图4所示。结果表明,菌株TZK-1与Rhizopus oryzae(AF229435)和Rhizopus oryzae(JN689988)聚为一支,支持强度达到92%,同源性分别达到99.5%和96.6%,与其同源性最低的是Rhizopus microsporus var. chinensis(EF405962),同源性为55.6%,可以看出TZK-1脂肪酶在遗传距离上与Rhizopus oryzae比较近,与Rhizopus microsporus var. chinensis较远。

将扩增得到的米根霉脂肪酶基因序列翻译成氨基酸序列后,利用MEGA 5.0软件构建产脂肪酶菌株的氨基酸系统发育树,结果如图5所示。由图5可知,菌株TZK-1与Rhizopus oryzae(AF229435)和Rhizopus oryzae(JN689988)聚类成一支,支持强度达到95%,同源性分别达到97.5%和96.1%,与其同源性最低的是Synthetic construct(GU475119),同源性为9.7%。由此可知,无论在核苷酸水平还是氨基酸水平上,扩增得到的脂肪酶都与Rhizopus oryzae脂肪酶具有较高的相似性,因此初步认为扩增得到的脂肪酶基因为米根霉脂肪酶基因。

3 小结与讨论

米根霉脂肪酶具有高度的1、3位置特异性,可以水解和再合成三甘油酯的第一位酯键,可以用来水解、重组脂肪和油脂,在芳香酯、手性化合物、生物柴油等有机物的合成中具有较高价值。伴随着脂肪酶的商业价值问题也是突出的,其中包括天然菌株产脂肪酶产量低,酶与菌体分离纯化困难,产物纯度达不到工业化生产要求等问题,因此利用分子生物学手段扩增脂肪酶基因作为一种高效表达的生产方法已经成为研究的热点。

本研究从采集的香料植物天竺葵样品中分离得到一株产脂肪酶菌株,通过对该菌进行形态学观察和18S rDNA序列测定,测序结果表明该菌株与米根霉(Rhizopus oryzae)具有最高的遗传相似性,再结合形态学可以确定该菌株为米根霉。通过PCR扩增该菌株脂肪酶基因和NCBI数据库比对,发现扩增得到的脂肪酶基因与NCBI提交的Rhizopus oryzae(AF229435)和Rhizopus oryzae(JN689988)脂肪酶核苷酸和氨基酸序列具有着较高的同源性。说明本研究成功扩增得到全长为1 108 bp,编码369个氨基酸的基因可能为米根霉脂肪酶基因,为挖掘我国的产脂肪酶微生物及其对脂肪酶的研究提供了材料。

TZK-1菌株在发酵培养基培养过程中,能产生浓郁的甜酒香味,这种香味的存在可能与菌株产生的某种或某些代谢产物有关,同时菌株代谢过程中产生的甜酒气味可能与脂肪酶的存在有着某种联系,这对米根霉产香化合物的发酵优化提供理论指导。探究该菌产香化合物的发酵优化及其产生的有关代谢产物组成,并对产香代谢化合物进行分离、提纯将成为后期研究的内容。

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(责任编辑 赵 娟)

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