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拈抗细菌对烟草黑胫病的防治效果研究

李 祝1,万 科1,丛 铭1,张传萍1,施渺筱2

(1.贵州大学生命科学学院真菌资源研究所,贵阳 550025;2.贵州省安顺学院农学院,贵州 安顺 561000)

摘要:采用温室盆栽试验测试5株芽孢杆菌属生防细菌对烟草黑胫病的拮抗作用。结果表明,拮抗细菌芽孢杆菌1205对苗期烟草黑胫病有较稳定的防治效果,其分泌物还有促进烟株生长的作用,经鉴定1205菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

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关键词 :拮抗细菌;烟草黑胫病;盆栽试验

中图分类号:S435.72 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2015)05-1094-03

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.016

收稿日期:2014-06-16

基金项目:贵州省科学技术厅、安顺市人民政府、安顺学院联合科技基金项目(黔科合J字LKA[2012]06号);毕节市烟草公司项目

作者简介:李 祝(1978-),女,贵州毕节人,教授,博士,主要从事农业微生物学研究,(电话)13595155081(电子信箱)zhuliluck@163.com。

烟草黑胫病[Phytophthora parasitica var. nicotianae(Breda de Hean)Tuker]俗称烂腰病、黑根病,是一种常见的土传真菌病害。烟草黑胫病在苗床及大田中均可发生,尤其是在高温高湿、多雨年份及低洼地区,该病发展蔓延快,在1~2周内可造成整块烟田毁灭,导致绝收[1,2]。随着生物技术的发展和相关研究的深入,生物防治成为烟草黑胫病的研究重点,特别是在利用有益微生物进行病害防治等方面[3-7]。本研究对筛选出来的5株生防细菌进行盆栽防效试验,以研究其对烟草黑胫病的拮抗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

烟草黑胫病菌病原菌烟草疫霉(Phytophthora parasitica Gzufp-9)由贵州大学生命科学院真菌资源研究室提供。拮抗细菌为芽孢杆菌1107、7403、1205、1601、5801菌株。烟草品种为毕纳1号。

1.2 盆栽试验方法

1.2.1 烟草育苗 采用漂浮育苗法,育苗前将浮盘和盛水方盘进行消毒,检查盘孔是否堵塞,用松散基质填满孔穴,用手指轻微下压至有实落感,约下压1 cm,然后装满刮平露出盘面孔格,每孔播种毕纳1号种子2~3粒,播种后不再盖基质,立即放入盛有适量水的方盘内。待出苗具备2片真叶时即可进行间苗,确保每孔内有1株均匀一致的烟苗。在烟苗已具有4叶1心,苗高3~4 cm时剪叶,剪去超过盘孔的根系控制大苗生长,促使小苗生长。后期剪叶两次,促进茎部的生长,达到炼苗的目的[8]。移栽,每盆1株,10 d后进行处理。

1.2.2 烟草疫霉孢子悬浮液的制备 利用已分离出的烟草疫霉菌菌株Gzufp-9,参照烟草疫霉孢子悬浮液制备方法[9]制备烟草疫霉孢子悬浮液,孢子浓度为104个/mL。

1.2.3 拮抗细菌接种物的制备 在NA平板上将分离得到的拮抗菌株1107、7403、1205、1601和5801活化,取两环活化的培养物分别接入盛有100 mL NA培养液的250 mL三角瓶中,28 ℃、160 r/min培养3 d,得到拮抗菌株悬浮液。

1.2.4 接种方法 病原菌接种采用王丽珍[10]的方法,将烟草疫霉孢子悬浮液灌根接种于烟株根部土壤中。拮抗细菌采用灌根接种法,将已经制备好的浓度为1×108个/mL拮抗菌发酵液灌根,接种于烟株根部土壤中。选择长势大小相近,苗龄40 d的烟苗,移栽到盆内,每盆1株,移栽10 d后接种,试验设6个处理,每个处理15株,设3次重复。①处理组1:在烟株移栽10 d后,首先接种拮抗菌发酵液10 mL,10 d后再接种烟草黒胫病病原菌游动孢子悬浮液(104个/mL)10 mL;②处理组2:在烟株移栽10 d后同时接种烟草黒胫病病原菌游动孢子悬浮液(104个/mL)10 mL和拮抗菌发酵液10 mL;③处理组3:在烟株移栽10 d后,首先接种烟草黒胫病病原菌游动孢子悬浮液(104个/mL)10 mL,10 d后再接种拮抗菌发酵液10 mL;④发病对照组:在烟株移栽10 d后只接种烟草黒胫病病原菌游动孢子悬浮液(104个/mL)20 mL,不接种拮抗菌;⑤拮抗菌对照组:在烟株移栽10 d后接种拮抗菌发酵液20 mL,不接种病原菌;⑥空白对照组:在烟株移栽10 d后接种清水20 mL。

1.3 小区试验

在贵州省毕节市黔西县进行田间试验,所有试验小区的栽培条件均匀一致,试验期间管理按照常规进行,拮抗菌田间药效试验小区按随机排列的方式进行。

1.3.1 施药方法 在烟株移栽前采用拮抗菌发酵液喷洒方式施用到土壤中,移栽后拮抗菌以灌根的方式接种到烟株根部。选用生产中常用的器械,菌种发酵采用泰斯特6000Ⅱ型培养箱,记录所用器械的类型和操作条件的全部资料。菌种的施用应保证接种量准确,分布均匀。接种量偏差超过±10%的要记录。第一次接种在烟株移栽前10 d,烟株移栽后每隔10 d接种1次,共接种3次,记录每次接种的日期和作物生育期。分别配置菌悬液浓度为102、103、104、105、106、107、108、109个/mL的1205菌株制剂,每株接种20 mL。设阳性药对照处理,在烟株移栽前10 d接种58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂(800×)喷淋茎基部。每处理设4次重复,每个小区面积为15 m2,随机区组排列,小区间筑埂隔离,以防药液串流。

1.3.2 调查、记录和测量方法 接种前调查1次,分别在施药后7、14、21 d各调查1次。病害分级标准按国家行业标准YC/T39-1996规定执行。病情分级标准如下:0级,全株无病;1级,茎部病斑不超过茎围的1/2或1/2以下,叶轻度凋萎,或下部少数叶片出现病斑;2级,茎部病斑超过茎围的1/2或1/2以上叶片凋萎;3级,茎部病斑环绕茎围或2/3以上叶片凋萎;4级,病株全叶凋萎或枯死。目测法调查记录拮抗菌对目标病原菌的拮抗效果,同时记录对作物有益的影响(如加速成熟、增加活力等)。药效按公式(1)和(2)计算。

式中,对照病指为空白对照区接菌后的病情指数;处理病指为拮抗试验区接种拮抗菌后的病情指数。

1.3.3 拮抗细菌对烟株生长的影响 以烟株生长后期为观测样本,每处理随机选择25株,分别测量其株高、节距、茎围、叶长、叶宽、有效叶片数等指标。对各处理的促生效果采用数据处理系统SPSS17.0进行K-S检验。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌盆栽防效的筛选

通过盆栽试验,接种5 d后,分别对各个处理进行调查。空白对照、拮抗菌对照和处理组2均未发病,而发病对照、处理组1和处理组3中的烟株已陆续发病,处理组3中的有些烟株发病级数也从1级达到了4级。

烟苗移栽40 d时,拮抗菌对照长势良好(表1);处理组1中发病指数都相对较低,各菌株的防效都达到了65.00%以上,尤其1205菌株相对防效达到了80.44%;处理组2中1601、7403、5801菌株处理的烟株发病指数相对较高,而经1107和1205菌株处理的烟苗生长良好,尤其1205菌株相对防效达到了84.79%;处理组3中发病指数相对较高,1601、5801、7403菌株处理的烟株相对防效在30.00%以下,只有1205菌株的相对防效达到了78.23%。由此可见,1205菌株对病原菌不仅有预防效果,还有较好的治疗和钝化作用。因此,选取1205菌株进行浓度筛选试验。

2.2 1205菌株的小区试验

为了更充分地说明1205菌株对烟草黑胫病的防效及掌握菌株的施用量,以58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂为阳性对照药,将1205菌株设计了8个菌悬液浓度梯度,采用随机区组排列方法,进行了药筛试验,结果见表2。防治效果随着菌悬液浓度的增加而增加,当菌悬液浓度达到105个/mL时,相对防效就达到了54.1%,优于化学药剂甲霜灵·锰锌的防效(50.6%),当菌悬液浓度达到109个/mL时,田间相对防效达到了75.9%。可见1205菌株对于烟草黑胫病的防治效果是稳定的。

2.3 1205菌株对烟草植株生长的影响

小区试验中观察1205菌株不同菌悬液浓度对烟草植株的生长情况(表3)表明,与对照相比,不同浓度的菌悬液对烟草植株的生长均有不同程度的影响,其中当1205菌株菌悬液浓度达到109个/mL时,表现尤为突出,与对照药58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂相比,株高、茎围、叶长、叶宽、有效叶片数分别增长了13%、15%、3%、33%、10%;而与对照相比,株高、茎围、叶长、叶宽、有效叶片数分别增长了13%、16%、19%、40%、10%。由此可见,1205菌株的分泌物还具有促进烟株生长的作用。

2.4 1205菌株的种类鉴定

将1205菌株接种在普通琼脂平板上,37 ℃培养36 h,菌落近圆形,灰白色,不透明,菌落大,直径达3~7 mm,边缘不整齐呈扩展状,表面粗糙颗粒状似毛玻璃状或蜡状,不分泌色素,为革兰氏阳性细菌,杆状,1.0~1.3 μm×3.0~5.0 μm,成链,具有运动性,芽孢椭圆形,端生或次端生,芽孢膨大不明显,能耐受7%NaCl,接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性、麦芽糖发酵阳性、半固体穿刺试验阳性、酪素水解阳性、VP试验阴性、柠檬酸盐利用试验阴性、吲哚试验阴性、蔗糖发酵阴性、乳糖发酵阴性、甘露醇水解阴性。参考《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)、《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》,初步鉴定为芽孢杆菌属。将1205菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中,160 r/min、28 ℃培养12 h,离心收集菌体。采用上海生工生物工程股份有限公司生产的柱式基因组DNA抽提试剂盒(细菌)提取基因组DNA。以提取到的DNA为模板,用正向引物16SF(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物16SR(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)对菌株的16S rDNA基因进行PCR扩增。PCR扩增条件为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 45 s,54 ℃ 30 s,72℃ 1 min,25个循环;72 ℃终延伸5 min,4 ℃停止。PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司测序,长度为1 468 bp。测序结果在GenBank中与Bacillus cereus相似性为97%。综合菌落形态、生理生化及分子鉴定,将1205菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

4 小结与讨论

本试验在对筛选出来的1107、7403、1205、1601、5801 5株生防细菌进行盆栽防效试验的过程中,发现1205菌株对烟草黑胫病具有较稳定的防治效果,防治效果随着菌悬液浓度的增加而增加。且1205菌株的分泌物还具有促进烟株生长的作用。经鉴定1205菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。对于1205菌株抑制烟草黑胫病的生理机制,尚待进一步研究。

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